Q: 什么是特定的抗體？

抗體（Ab），也被稱為免疫球蛋白（Ig），是一種Y型的蛋白質(zhì)，通過Fab區(qū)域的可變區(qū)域來中和病原體，例如致病性細菌和病毒。

Q: 如何選擇適合我的實驗的正確抗體？CUSABIO是否提供具有多種應(yīng)用的抗體？

您在選擇抗體時需要注意以下幾個方面：樣本的物種、抗體的宿主物種、抗體的標(biāo)記方式以及適用于您實驗的推薦稀釋比例。CUSABIO保證其抗體適用于標(biāo)注在網(wǎng)站或產(chǎn)品數(shù)據(jù)表上的應(yīng)用和物種。如果您使用的應(yīng)用我們沒有測試過，我們將為您提供試用樣品，在購買正裝之前進行評估。

Q: 單克隆抗體和多克隆抗體有什么區(qū)別？

單克隆抗體是使用相同的克隆免疫細胞制備而成，它們都是來自一個特定的母細胞的克隆。因此，它們對同一抗原和表位具有親和力。多克隆抗體是使用多個不同的免疫細胞制備而成，它們對同一抗原具有親和力，但結(jié)合的表位不同。單克隆抗體只結(jié)合一個表位，而多克隆抗體則結(jié)合同一蛋白質(zhì)上的不同表位。單克隆抗體比多克隆抗體更加特異且背景噪音更少，因此在生化分析中通常更可取。然而，單克隆抗體的生產(chǎn)成本通常更高，適應(yīng)性較差，并且對抗原的微小變化非常敏感。

Q: 一抗和二抗之間有什么關(guān)系？如何選擇適合我實驗的正確二抗？

一般情況下，一抗用于捕獲目標(biāo)蛋白，二抗能夠與一抗結(jié)合，并且標(biāo)記有可以放大檢測信號的酶或染料。我們建議您考慮以下幾個因素：

a. 根據(jù)宿主物種選擇。例如，如果一抗來自小鼠，那么二抗應(yīng)該是抗小鼠的。

b. 根據(jù)一抗的特性選擇。

c. 根據(jù)您的實驗應(yīng)用，例如WB、IHC、ELISA等。

Q: 您能告訴我每個抗體結(jié)合多少個生物素嗎？

生物素與抗體的摩爾比為36.6:1。然而，很難準(zhǔn)確說出每個抗體結(jié)合了多少個生物素，因為標(biāo)記是通過賴氨酸殘基進行的，并不清楚有多少個原始氨基團與生物素結(jié)合。平均而言，每個IgG分子可以結(jié)合3—5個生物素分子。

Q: 為什么實際帶狀物的分子量大于理論分子量？

您可以使用CUSABIO的分子量計算器計算抗體的分子量。如果測試結(jié)果與理論分子量之間有很大差異，可能的原因包括：目標(biāo)蛋白存在多個修飾位點，例如糖基化，或者與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，或者被切割或降解。

Q：為什么我收到的抗體容量少于標(biāo)簽上所標(biāo)示的容量？

在運輸和儲存過程中，少量的抗體可能會附著在產(chǎn)品瓶蓋的密封處。如果需要，可以在臺式離心機上對瓶子進行短暫離心，以使容器蓋中的液體脫離。

Q: 您能為該抗體推薦同型對照嗎？

同型對照用于確認一抗結(jié)合的特異性，以排除非特異性Fc受體結(jié)合或其他蛋白質(zhì)相互作用的影響。同型對照抗體應(yīng)與一抗的宿主物種、同型和標(biāo)記方式相匹配。例如，如果一抗是FITC標(biāo)記的小鼠IgG1，那么您需要選擇一款FITC標(biāo)記的小鼠IgG1同型對照。大多數(shù)同型對照抗體是單克隆抗體，多克隆抗體不適用，因為多克隆抗體含有多個IgG亞類。

Q: 用哪種緩沖液來儲存抗體？

我們使用0.01M PBS緩沖液（pH 7.4）加入50%甘油。

Q: 您可以提供哪種類型的抗體標(biāo)記？

我們目前提供FITC、HRP、生物素等隨機標(biāo)記在游離的賴氨酸（Lys）氨基上的標(biāo)記。

Q: 為什么有些抗體不再提供？

我們從庫存中剔除這些抗體，是因為我們有新的產(chǎn)品替代它們。

Q: 為什么在免疫印跡（Western Blot）中沒有帶狀物？

可能存在的原因有：

a. 抗體不足。一些抗體可能與目標(biāo)蛋白的親和性較差。您應(yīng)該減少抗體的稀釋倍數(shù)（比推薦的起始稀釋度低2-4倍）。同時，抗體可能已失去活性，您應(yīng)該進行點印跡（Dot Blot）實驗。

b. 蛋白質(zhì)不足。您應(yīng)該提高在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。通過其他方法確認蛋白質(zhì)的存在。使用陽性對照（重組蛋白、細胞系或處理細胞以表達感興趣的分析物）。進行點印跡實驗。

c. 轉(zhuǎn)膜不良。您應(yīng)該用甲醇濕潤PVDF/Immobilon-P膜，或者用轉(zhuǎn)膜緩沖液濕潤硝酸纖維膜，以確保PVDF膜與凝膠之間有良好接觸。

d. 轉(zhuǎn)膜不全部。您應(yīng)該延長轉(zhuǎn)膜時間，因為一些分子量較大的蛋白質(zhì)可能需要更長的轉(zhuǎn)膜時間。

e. 過度轉(zhuǎn)膜。對于分子量較小（低于10 kDa）的蛋白質(zhì)，您應(yīng)該減少轉(zhuǎn)膜電壓或時間。

f. 等電點大于9。您應(yīng)該使用更高pH值的替代緩沖體系，如CAPS（pH 10.5）。

g. 使用了錯誤的二抗。您應(yīng)該確認一抗的宿主物種和抗體類型，以選擇正確的二抗。

h. 抗體無效。不要使用過期的抗體。

i. 存在偶氮二碘苯酚（Sodium azide）污染。確保緩沖液不含偶氮二碘苯酚，因為它可能熄滅HRP信號。

j. 一抗的孵育時間不足。您應(yīng)該延長一抗的孵育時間，最好過夜孵育在4℃。

Q: 在免疫印跡（Western Blot）中為什么信號弱？

可能存在的原因有：

a. 蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合較弱。您應(yīng)該盡量減少洗滌次數(shù)。減少抗體溶液中的NaCl濃度，或者在洗滌步驟中使用印跡緩沖液（推薦范圍為0.15 M-0.5 M）。

b. 抗體不足。您應(yīng)該將抗體濃度增加到比推薦的起始濃度高2-4倍。

c. 蛋白質(zhì)不足。您應(yīng)該提高在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。

d. 反應(yīng)偶聯(lián)不活性。您應(yīng)該在管中混合酶和底物。如果顏色不顯現(xiàn)或者顏色較弱，可以制備新的試劑或購買新的試劑。嘗試使用ECL。

e. ECL試劑過弱/過舊。您應(yīng)該購買新的ECL試劑。

f. 脫脂奶可能掩蓋了某些抗原。您應(yīng)該減少阻斷液中脫脂奶的百分比，或者用3%牛血清白蛋白（BSA）代替。

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Q: 為什么在免疫印跡（Western Blot）中出現(xiàn)額外的帶狀物？

可能存在的原因有：

a. 主抗體的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該增加主抗體的稀釋倍數(shù)。減少在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。使用單克隆抗體或抗原親和純化的抗體。

b. 二抗的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該進行一個只用二抗的對照試驗（不加主抗體）。如果出現(xiàn)條帶，則選擇其他二抗，使用單克隆抗體或抗原親和純化的抗體。

c. 分析物的降解。您應(yīng)該盡量減少樣品的凍融循環(huán)，存儲前向樣品中添加蛋白酶抑制劑，或制備新鮮樣品。

d. 分析物的聚集。您應(yīng)該增加DTT的用量以確保還原二硫鍵（20-100 mM DTT）。在加載凝膠前，將樣品置于沸水中煮沸5—10分鐘。進行短時間的離心。

e. 試劑的污染。您應(yīng)該檢查緩沖液是否被污染，或者嘗試制備新鮮的試劑。

Q: 在免疫印跡（Western Blot）中為什么會出現(xiàn)條狀模糊？

可能存在的原因有：

a. 主抗體的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該將單克隆抗體或抗原親和純化的抗體以更低的濃度稀釋在5%牛奶中，或者調(diào)整非脫脂奶粉（2%-5%）或NaCl（0.15-0.5 M）濃度作為主抗體溶液。

b. 二抗的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該進行一個只用二抗的對照實驗（不加主抗體）。如果在膜上出現(xiàn)了條帶，則應(yīng)該稀釋該抗體或嘗試其他二抗。

c. 阻斷不足。您應(yīng)該使用含有0.1%—0.5% Tween 20、0.15-0.5 M NaCl和25 mM Tris (pH 7.4）的5%脫脂奶粉溶液進行阻斷。可以延長阻斷時間。根據(jù)需要調(diào)整奶粉濃度。在4℃下過夜阻斷可能會降低阻斷效果，因為低溫下洗滌劑可能不起作用。

d. 洗滌不足。您應(yīng)該增加洗滌緩沖液中Tween 20的濃度（0.1%—0.5%），或增加洗滌次數(shù)。

e. 脫脂奶粉中可能含有目標(biāo)抗原或內(nèi)源性生物素，并且與親和素/鏈霉親和素不相容。您應(yīng)該使用3% BSA進行替代。

f. 某些IgY抗體可能會識別奶蛋白。您應(yīng)該使用3% BSA進行替代。

g. 膠片曝光過度。您應(yīng)該減少曝光時間。如果目標(biāo)信號過強，請多等待5—10分鐘后重新曝光膠片。

Q: 在免疫印跡（Western Blot）中，為什么條帶看起來模糊且不規(guī)則？

可能存在的原因有：

a. 凝膠不好。在填充之前應(yīng)全部攪拌溶液。

b. 某些樣品的鹽濃度較高。您應(yīng)該對樣品進行脫鹽或調(diào)整鹽濃度。

c. 每個孔中的樣品體積不一致。您應(yīng)該調(diào)整樣品體積，使其基本相同。

d. 緩沖液不起作用。您應(yīng)該購買新的緩沖液或制備新的緩沖液。

e. 膜中有氣泡困住。在轉(zhuǎn)膜過程中要小心地去除任何氣泡。

f. 電泳過程中溫度過高。您應(yīng)該減小電流或電壓。

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Q: 在免疫印跡（Western Blot）中，為什么轉(zhuǎn)膜效率低？

可能存在的原因有：

a. pH值接近等電點。您應(yīng)該增加轉(zhuǎn)膜緩沖液的pH值。

b. 膜中有氣泡困住。在轉(zhuǎn)膜過程中要小心地去除任何氣泡。

c. 濾紙接觸。濾紙、轉(zhuǎn)膜和凝膠的大小應(yīng)基本相同，以避免濾紙直接接觸。

d. 轉(zhuǎn)膜選擇不當(dāng)。您應(yīng)該使用可靠的PVDF膜或硝酸纖維膜。

e. 電壓或電流過低。我們建議在濕轉(zhuǎn)膜過程中使用20 mA的恒定電流，半干轉(zhuǎn)膜時使用25 V的恒定電壓。

f. 轉(zhuǎn)膜時間過長或過短。根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和使用的電泳設(shè)備，選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)膜時間。

g. 濕轉(zhuǎn)膜過程中環(huán)境溫度過高。您應(yīng)該使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置設(shè)置為4℃。

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Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么染色缺失？

可能存在的原因有：

a. 缺乏抗原。我們建議通過原位雜交檢測蛋白質(zhì)的表達，因為在某些罕見情況下，即使已檢測到mRNA，蛋白質(zhì)的翻譯可能被阻斷。

b. 抗原在與一抗孵育之前被破壞。如果在添加一抗之前進行了內(nèi)源性過氧化物酶的消除，您應(yīng)該在與一抗孵育后對過氧化物酶進行阻斷。

c. 抗原恢復(fù)效果不好。您應(yīng)該增加處理時間或更換處理溶液。

d. 抗體因存儲不當(dāng)而失效。您應(yīng)該按照手冊上的存儲說明操作。通常將抗體分裝成足夠制備單次實驗的小體積，避免反復(fù)凍融。

e. 一抗或二抗失活。您應(yīng)該獨立測試報告系統(tǒng)以評估試劑的有效性。

f. 一抗和二抗不兼容。您應(yīng)該使用能與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗是兔源的，則使用抗兔二抗。

g. 組織固定不充分。您可以嘗試增加固定時間或嘗試不同的固定劑。

h. 組織過度固定。您應(yīng)該減少浸泡或后固定步驟的時間。如果無法避免浸泡固定，可以通過使用抗原恢復(fù)試劑來使抗原重新顯露。

i. 抗原在固定或包埋過程中發(fā)生變化。您可以嘗試通過各種抗原恢復(fù)技術(shù)來恢復(fù)免疫反應(yīng)性。

j. 遺漏或錯誤使用試劑。您應(yīng)該重復(fù)染色，并確認正確使用了正確順序的試劑。

Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么染色結(jié)果不合適？

可能存在的原因有：

a. 固定方法對抗原不適用。您可以嘗試不同的固定劑或增加固定時間。

b. 抗原恢復(fù)方法對該抗原或組織不適用。您可以嘗試不同的抗原恢復(fù)條件。

c. 抗原的靜電荷發(fā)生了變化。您可以嘗試調(diào)整抗體稀釋液的pH值或陽離子濃度。

d. 固定延遲導(dǎo)致抗原擴散。您應(yīng)該及時固定組織，并嘗試使用交聯(lián)固定劑而不是有機（醇）固定劑。

Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么背景較高？

可能存在的原因有：

a. 一抗和/或二抗?jié)舛冗^高。您應(yīng)該進行滴定實驗，確定促進一抗和二抗特異反應(yīng)所需的最佳濃度。

b. 一抗或二抗與組織的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該在一抗孵育之前進行阻斷步驟。非脂乳粉是另一個選擇。

c. 二抗的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該使用去除了交叉反應(yīng)IgG物種的抗體（對樣本物種進行吸附）。

d. 抗體與組織中的蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用。您應(yīng)該降低抗體稀釋液的離子強度。

e. 背景由離子相互作用引起。您應(yīng)該增加稀釋緩沖液的離子強度。

f. 組織變干。在染色過程中避免組織變干。

g. 試劑附著在老舊或準(zhǔn)備不良的玻片上。您應(yīng)該重新準(zhǔn)備新鮮的或購買的玻片。

Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么組織或細胞形態(tài)會被破壞？

可能存在的原因有：

a. 抗原恢復(fù)方法過于嚴(yán)酷。您應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗確定能夠保持組織形態(tài)的條件，同時恢復(fù)抗原的免疫活性。

b. 組織切片脫落玻片。您應(yīng)該增加固定時間。根據(jù)經(jīng)驗確定額外或替代性的固定劑。使用新鮮制備的、電荷充足的玻片。

c. 染色過程中未全部固定導(dǎo)致物理損傷組織或細胞。您應(yīng)該增加固定時間和/或增加后固定步驟。增加固定劑/組織比例。切割更小的組織塊以進行更全部地浸潤固定。

d. 組織自溶導(dǎo)致壞死碎片染色。您應(yīng)該增加固定時間和比例。考慮使用交聯(lián)固定劑。

e. 組織切片出現(xiàn)撕裂或折疊。您應(yīng)該在切片下除去氣泡。使用鋒利的刀片重新切割切片，或在分析結(jié)果時忽略損壞區(qū)域。

f. 組織形態(tài)分辨率差。對于冰凍切片，應(yīng)該切割更薄的組織切片，因為冰晶可能破壞了組織形態(tài)。

Q: 在免疫沉淀（IP）中，為什么會有太多的抗體洗脫？

您應(yīng)該在進行免疫沉淀前將抗體與珠子混合，并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫，這樣可以顯著減少抗體的數(shù)量。

Q: 為什么免疫沉淀（IP）中的背景太高？

可能存在的原因有：

a. 抗體與非特異性結(jié)合過多。您應(yīng)該使用純化的抗體，并減少使用的量。

b. 細胞過多/蛋白質(zhì)過多導(dǎo)致洗脫物中存在大量非特異性蛋白質(zhì)。減少使用的細胞數(shù)量/裂解液（10-500 µg）。

c. 不能溶解的蛋白質(zhì)殘留。在離心后立即去除上清液。這樣應(yīng)該將不溶性蛋白質(zhì)留在沉淀中。如果重新懸浮發(fā)生，再次離心。

d. 準(zhǔn)備的珠子過少。您應(yīng)該確保BSA新鮮，并使用足夠的珠子在PBS中含有1%的BSA中孵育1小時。在使用之前用PBS洗滌3—4次。

e. 洗滌不干凈。您應(yīng)該在相關(guān)階段進行充分的洗滌，將蓋子蓋在離心管上，并在離心之前多次倒置。

f. 在免疫沉淀過程中，抗原降解。您應(yīng)該在裂解之前添加新鮮的蛋白酶抑制劑。

Q: 在染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）中，為什么大區(qū)域顯示低分辨率且背景噪音高？

您應(yīng)該優(yōu)化DNA片段（不超過1.5 kb）。

Q: 為什么在染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）中樣本中無法擴增DNA？

您應(yīng)該選擇陽性對照模板DNA來確認引物的工作情況。

Q: 在流式細胞術(shù)（FC）中為什么會有高背景？

可能存在的原因有：

a. 增益設(shè)置過高。您應(yīng)該降低增益以減少信號，并使用陽性對照來正確設(shè)置流式細胞儀。

b. 抗體過多。您應(yīng)該減少抗體濃度。

Q: 為什么在流式細胞術(shù)（FC）中觀察到兩個或更多的細胞群體？

可能存在的原因有：

a. 存在多個細胞群體表達目標(biāo)蛋白。您應(yīng)該檢查細胞分離是否充分。

b. 存在細胞二聚體。細胞二聚體將顯示為圖上大約兩倍熒光強度的第二個細胞群體。您應(yīng)該在染色之前和在流式細胞儀上運行之前使用移液管輕輕混合細胞。

Q: 我應(yīng)該如何儲存和分裝抗體？

抗體在室溫下只穩(wěn)定幾天。請在收到后將抗體分裝并儲存在-20℃。請避免反復(fù)凍結(jié)和解凍，您可以根據(jù)實驗中使用的量來分裝抗體，但每個分裝物的量不應(yīng)少于10 μL。每個分裝物的量越小，液體蒸發(fā)和容器吸附對抗體濃度的影響就越大。

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